Absorpsjon og videre re-emisjon av lys av uorganiske og organiske medier er et resultat av fosforescens eller fluorescens. Forskjellen mellom fenomenene er lengden på intervallet mellom lysabsorpsjon og emisjon av strømmen. Med fluorescens skjer disse prosessene nesten samtidig, og med fosforescens, med noe forsinkelse.
Historisk bakgrunn
I 1852 beskrev den britiske forskeren Stokes først fluorescens. Han laget det nye begrepet som et resultat av sine eksperimenter med flusspat, som sendte ut rødt lys når de ble utsatt for ultrafiolett lys. Stokes bemerket et interessant fenomen. Han fant ut at bølgelengden til fluorescerende lys alltid er lengre enn eksitasjonslyset.
Mange eksperimenter ble utført på 1800-tallet for å bekrefte hypotesen. De viste at en rekke prøver fluorescerer når de ble utsatt for ultrafiolett lys. Materialer inkluderte blant annet krystaller, harpikser, mineraler, klorofyll,medisinske råvarer, uorganiske forbindelser, vitaminer, oljer. Den direkte bruken av fargestoffer for biologisk analyse begynte først i 1930
Fluorescensmikroskopibeskrivelse
Noen av materialene som ble brukt i forskning i første halvdel av 1900-tallet var svært spesifikke. Takket være indikatorer som ikke kunne oppnås med kontrastmetoder, har fluorescensmikroskopimetoden blitt et viktig verktøy i både biomedisinsk og biologisk forskning. Resultatene som ble oppnådd var av ikke liten betydning for materialvitenskap.
Hva er fordelene med fluorescensmikroskopi? Ved hjelp av nye materialer ble det mulig å isolere svært spesifikke celler og submikroskopiske komponenter. Et fluorescerende mikroskop lar deg oppdage individuelle molekyler. En rekke fargestoffer lar deg identifisere flere elementer samtidig. Selv om den romlige oppløsningen til utstyret er begrenset av diffraksjonsgrensen, som igjen avhenger av prøvens spesifikke egenskaper, er deteksjon av molekyler under dette nivået også fullt mulig. Ulike prøver viser autofluorescens etter bestråling. Dette fenomenet er mye brukt i petrologi, botanikk, halvlederindustri.
Funksjoner
Studien av dyrevev eller patogene mikroorganismer er ofte komplisert av enten for svak eller veldig sterk uspesifikk autofluorescens. Imidlertid er verdien iforskning oppnår introduksjonen til materialet av komponenter som er opphisset ved en spesifikk bølgelengde og sender ut en lysstrøm med den nødvendige intensiteten. Fluorokromer fungerer som fargestoffer som kan feste seg selv til strukturer (usynlige eller synlige). Samtidig utmerker de seg ved høy selektivitet med hensyn til mål og kvanteutbytte.
Fluorescensmikroskopi har blitt mye brukt med bruk av naturlige og syntetiske fargestoffer. De hadde spesifikke utslipps- og eksitasjonsintensitetsprofiler og var rettet mot spesifikke biologiske mål.
Identifisering av individuelle molekyler
Ofte, under ideelle forhold, kan du registrere gløden til et enkelt element. For å gjøre dette er det blant annet nødvendig å sørge for tilstrekkelig lav detektorstøy og optisk bakgrunn. Et fluoresceinmolekyl kan avgi opptil 300 000 fotoner før de ødelegges på grunn av fotobleking. Med en innsamlingsgrad på 20 % og prosesseffektivitet, kan de registreres i et beløp på rundt 60 tusen
Fluorescensmikroskopi, basert på skredfotodioder eller elektronmultiplikasjon, gjorde det mulig for forskere å observere oppførselen til individuelle molekyler i sekunder, og i noen tilfeller minutter.
Vanskeligheter
Nøkkelproblemet er støydemping fra den optiske bakgrunnen. På grunn av det faktum at mange av materialene som brukes i konstruksjonen av filtre og linser viser en viss autofluorescens, var innsatsen til forskere i de innledende stadiene fokusert på å utstedekomponenter med lav fluorescens. Påfølgende eksperimenter førte imidlertid til nye konklusjoner. Spesielt har fluorescensmikroskopi basert på total intern refleksjon blitt funnet å oppnå lav bakgrunn og høy eksitasjonslyseffekt.
Mechanism
Prinsippene for fluorescensmikroskopi basert på total intern refleksjon er å bruke en raskt henfallende eller ikke-forplantende bølge. Det oppstår i grensesnittet mellom medier med forskjellige brytningsindekser. I dette tilfellet passerer lysstrålen gjennom et prisme. Den har en høy brytningsindeks.
Prismet er ved siden av en vandig løsning eller glass med lav parameter. Hvis lysstrålen rettes mot den i en vinkel som er større enn den kritiske, blir strålen fullstendig reflektert fra grensesnittet. Dette fenomenet gir i sin tur opphav til en ikke-forplantende bølge. Det genereres med andre ord et elektromagnetisk felt som trenger inn i et medium med lavere brytningsindeks i en avstand på mindre enn 200 nanometer.
I en ikke-forplantende bølge vil lysintensiteten være ganske tilstrekkelig til å eksitere fluoroforer. På grunn av sin eksepsjonelt grunne dybde vil volumet imidlertid være veldig lite. Resultatet er en bakgrunn på lavt nivå.
Endring
Fluorescensmikroskopi basert på total intern refleksjon kan realiseres med epi-belysning. Dette krever linser med økt numerisk blenderåpning (minst 1,4, men det er ønskelig at den når 1,45-1,6), samt et delvis opplyst felt av apparatet. Sistnevnte oppnås med en liten flekk. For større jevnhet brukes en tynn ring, gjennom hvilken en del av strømmen blokkeres. For å oppnå en kritisk vinkel hvoretter total refleksjon oppstår, er det nødvendig med et høyt brytningsnivå av nedsenkingsmediet i linsene og mikroskopets dekkglass.