Protein er en essensiell komponent i alle organismer. Hvert av dets molekyler består av en eller flere polypeptidkjeder som består av aminosyrer. Selv om informasjonen som er nødvendig for liv er kodet i DNA eller RNA, utfører rekombinante proteiner et bredt spekter av biologiske funksjoner i organismer, inkludert enzymatisk katalyse, beskyttelse, støtte, bevegelse og regulering. I henhold til deres funksjoner i kroppen, kan disse stoffene deles inn i forskjellige kategorier, for eksempel antistoffer, enzymer, strukturelle komponenter. Gitt deres viktige funksjoner, har slike forbindelser blitt intensivt studert og mye brukt.
Tidligere var den viktigste måten å oppnå et rekombinant protein på å isolere det fra en naturlig kilde, som vanligvis er ineffektivt og tidkrevende. Nylige fremskritt innen biologisk molekylær teknologi har gjort det mulig å klone DNA som koder for et spesifikt sett med stoffer til en ekspresjonsvektor for stoffer som bakterier, gjær, insektceller og pattedyrceller.
Enkelt sagt, rekombinante proteiner blir oversatt av eksogene DNA-produkter tillevende celler. Å få dem innebærer vanligvis to hovedtrinn:
- Kloning av et molekyl.
- Protein-uttrykk.
For tiden er produksjonen av en slik struktur en av de kraftigste metodene som brukes innen medisin og biologi. Komposisjonen har en bred anvendelse innen forskning og bioteknologi.
medisinsk veiledning
Rekombinante proteiner gir viktige behandlinger for ulike sykdommer som diabetes, kreft, infeksjonssykdommer, hemofili og anemi. Typiske formuleringer av slike substanser inkluderer antistoffer, hormoner, interleukiner, enzymer og antikoagulanter. Det er et økende behov for rekombinante formuleringer for terapeutisk bruk. De lar deg utvide behandlingsmetoder.
genetisk konstruerte rekombinante proteiner spiller en nøkkelrolle i det terapeutiske legemiddelmarkedet. Pattedyrceller produserer for tiden de mest terapeutiske midlene fordi deres formuleringer er i stand til å produsere naturlig-lignende stoffer av høy kvalitet. I tillegg produseres mange godkjente rekombinante terapeutiske proteiner i E. coli på grunn av god genetikk, rask vekst og høy produktivitet. Det har også en positiv effekt på utviklingen av legemidler basert på dette stoffet.
Research
Å skaffe rekombinante proteiner er basert på forskjellige metoder. Stoffer hjelper til med å finne ut kroppens grunnleggende og grunnleggende prinsipper. Disse molekylene kan brukes til å identifisere og bestemmeplassering av stoffet kodet av et bestemt gen, og for å avsløre funksjonen til andre gener i ulike cellulære aktiviteter som cellesignalering, metabolisme, vekst, replikasjon og død, transkripsjon, translasjon og modifikasjon av forbindelsene omt alt i artikkelen.
Den observerte sammensetningen brukes derfor ofte innen molekylærbiologi, cellebiologi, biokjemi, strukturelle og biofysiske studier og mange andre vitenskapsfelt. Samtidig er det en internasjonal praksis å skaffe rekombinante proteiner.
Slike forbindelser er nyttige verktøy for å forstå intercellulære interaksjoner. De har vist seg effektive i flere laboratoriemetoder som ELISA og immunhistokjemi (IHC). Rekombinante proteiner kan brukes til å utvikle enzymanalyser. Når de brukes i kombinasjon med et par passende antistoffer, kan celler brukes som standarder for nye teknologier.
Bioteknologi
Rekombinante proteiner som inneholder en aminosyresekvens brukes også i industri, matproduksjon, landbruk og bioteknikk. For eksempel, i dyrehold, kan enzymer tilsettes mat for å øke næringsverdien til fôringredienser, redusere kostnader og avfall, støtte dyrs tarmhelse, forbedre produktiviteten og forbedre miljøet.
I tillegg melkesyrebakterier (LAB) i lang tidhar blitt brukt til å produsere fermentert mat, og nylig har LAB blitt utviklet for ekspresjon av rekombinante proteiner som inneholder en aminosyresekvens, som kan brukes mye, for eksempel for å forbedre menneskers, dyrs og ernæringsmessige fordøyelse.
Disse stoffene har imidlertid også begrensninger:
- I noen tilfeller er produksjonen av rekombinante proteiner kompleks, kostbar og tidkrevende.
- Stoffer produsert i celler samsvarer kanskje ikke med naturlige former. Denne forskjellen kan redusere effektiviteten til terapeutiske rekombinante proteiner og til og med forårsake bivirkninger. I tillegg kan denne forskjellen påvirke resultatene av eksperimenter.
- Hovedproblemet med alle rekombinante legemidler er immunogenisitet. Alle bioteknologiske produkter kan utvise en form for immunogenisitet. Det er vanskelig å forutsi sikkerheten til nye terapeutiske proteiner.
Generelt har fremskritt innen bioteknologi økt og forenklet produksjonen av rekombinante proteiner for en rekke bruksområder. Selv om de fortsatt har noen ulemper, er stoffene viktige innen medisin, forskning og bioteknologi.
sykdomslink
rekombinant protein er ikke skadelig for mennesker. Det er bare en integrert del av det totale molekylet i utviklingen av et bestemt medikament eller ernæringselement. Mange medisinske studier har vist at tvungen ekspresjon av FGFBP3-proteinet (forkortet BP3) i en laboratoriestamme av overvektige mus viste en betydelig reduksjon i kroppsfettet.masse, til tross for den genetiske disposisjonen for bruk.
Resultatene av disse forsøkene viser at FGFBP3-proteinet kan tilby en ny terapi for lidelser assosiert med metabolsk syndrom som diabetes type 2 og fettleversykdom. Men fordi BP3 er et naturlig protein og ikke et kunstig medikament, kan kliniske studier av rekombinant humant BP3 begynne etter den siste runden med prekliniske studier. På, det vil si at det er grunner knyttet til sikkerheten ved å gjennomføre slike studier. Det rekombinante proteinet er ikke skadelig for mennesker på grunn av dets trinnvise prosessering og rensing. Endringer skjer også på molekylært nivå.
PD-L2, en av nøkkelaktørene innen immunterapi, ble nominert til 2018 Nobelprisen i fysiologi eller medisin. Dette arbeidet, startet av prof. James P. Allison fra USA og prof. Tasuku Honjo fra Japan, har ført til behandling av kreftformer som melanom, lungekreft og andre basert på sjekkpunkt-immunterapi. Nylig har AMSBIO lagt til et stort nytt produkt til sin immunterapilinje, PD-L2/TCR-aktivatoren - CHO Recombinant Cell Line.
I proof-of-concept-eksperimenter har forskere ved University of Alabama i Birmingham, ledet av H. Long Zheng, MD, professor Robert B. Adams, og direktør for Laboratory Medicine, Department of Pathology, UAB School of Medisin, har fremhevet en potensiell terapi, en sjelden, men dødelig blødningsforstyrrelse, TTP.
Resultatene av dettestudier viser for første gang at transfusjon av rADAMTS13-lastede blodplater kan være en ny og potensielt effektiv terapeutisk tilnærming for arteriell trombose assosiert med medfødt og immun-mediert TTP.
Rekombinant protein er ikke bare et næringsstoff, men også et medikament i sammensetningen av legemidlet som utvikles. Dette er bare noen få områder som nå er involvert i medisin og relatert til studiet av alle dens strukturelle elementer. Som internasjonal praksis viser, gjør strukturen til et stoff det mulig på molekylært nivå å håndtere mange alvorlige problemer i menneskekroppen.
Vaksineutvikling
Et rekombinant protein er et spesifikt sett med molekyler som kan modelleres. En lignende egenskap brukes i utviklingen av vaksiner. En ny vaksinasjonsstrategi, også kjent som bruken av en spesiell rekombinant virusinjeksjon, kan beskytte millioner av kyllinger i fare for en alvorlig luftveissykdom, sa forskere fra University of Edinburgh og Pirbright Institute. Disse vaksinene bruker harmløse eller svake versjoner av et virus eller en bakterie for å introdusere bakterier i kroppens celler. I dette tilfellet brukte eksperter rekombinante virus med forskjellige piggproteiner som vaksiner for å lage to versjoner av et ufarlig virus. Det er mange forskjellige medikamenter bygget rundt denne forbindelsen.
Handelsnavn og analoger for rekombinant protein er som følger:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Dette er hovedsakelig kreftmedisiner, men det er andre behandlingsområder knyttet til dette aktive stoffet.
En ny vaksine, også k alt LASSARAB, designet for å beskytte mennesker mot både Lassa-feber og rabies, har vist lovende resultater i prekliniske studier, ifølge en ny studie publisert i det vitenskapelige tidsskriftet Nature Communications. En inaktivert rekombinant vaksinekandidat bruker et svekket rabiesvirus.
Forskerteamet satte inn Lassa-virus-genetisk materiale i en rabiesvirusvektor slik at vaksinen skulle uttrykke overflateproteiner i både Lassa- og rabiesceller. Disse overflateforbindelsene fremkaller en immunrespons mot smittestoffer. Denne vaksinen ble deretter inaktivert for å "ødelegge" det levende rabiesviruset som ble brukt til å lage bæreren.
Få metoder
Det finnes flere systemer for å produsere et stoff. Den generelle metoden for å oppnå et rekombinant protein er basert på å oppnå biologisk materiale fra syntesen. Men det finnes andre måter.
For øyeblikket er det fem hoveduttrykkssystemer:
- E. coli-ekspresjonssystem.
- Gjæruttrykkssystem.
- Uttrykkssystem for insektceller.
- pattedyrcelleekspresjonssystem.
- Cellefritt proteinekspresjonssystem.
Det siste alternativet er spesielt egnet for ekspresjon av transmembrane proteinerog giftige forbindelser. De siste årene har stoffer som er vanskelige å uttrykke ved konvensjonelle intracellulære metoder blitt vellykket integrert i celler in vitro. I Hviterussland er produksjonen av rekombinante proteiner mye brukt. Det er en rekke statseide foretak som arbeider med dette problemet.
Cell Free Protein Synthesis System er en rask og effektiv metode for å syntetisere målsubstanser ved å tilsette ulike substrater og energiforbindelser som er nødvendige for transkripsjon og translasjon i det enzymatiske systemet av cellulære ekstrakter. De siste årene har fordelene med cellefrie metoder for typer stoffer som komplekse, giftige membraner gradvis dukket opp, noe som viser deres potensielle anvendelse i det biofarmasøytiske feltet.
Cellefri teknologi kan tilføre en rekke ikke-naturlig forekommende aminosyrer enkelt og på en kontrollert måte for å oppnå komplekse modifikasjonsprosesser som er vanskelige å løse etter konvensjonell rekombinant ekspresjon. Slike metoder har høy bruksverdi og potensial for medikamentlevering og vaksineutvikling ved bruk av viruslignende partikler. Et stort antall membranproteiner har blitt uttrykt med suksess i frie celler.
Uttrykk for komposisjoner
Rekombinant protein CFP10-ESAT 6 produseres og brukes til å lage vaksiner. Et slikt tuberkuloseallergen lar deg styrke immunforsvaret og utvikle antistoffer. Generelt involverer molekylære studier studiet av ethvert aspekt av et protein, for eksempel struktur, funksjon, modifikasjoner, lokalisering eller interaksjoner. Å utforskehvordan spesifikke stoffer regulerer interne prosesser, krever forskere vanligvis midler for å produsere funksjonelle forbindelser av interesse og nytte.
Gitt størrelsen og kompleksiteten til proteiner, er ikke kjemisk syntese et levedyktig alternativ for denne bestrebelsen. I stedet blir levende celler og deres cellulære maskineri vanligvis brukt som fabrikker for å lage og konstruere stoffer basert på de angitte genetiske malene. Det rekombinante proteinekspresjonssystemet genererer deretter den nødvendige strukturen for å lage et medikament. Deretter kommer valget av nødvendig materiale for ulike kategorier av legemidler.
I motsetning til proteiner er DNA enkelt å konstruere syntetisk eller in vitro ved å bruke veletablerte rekombinante teknikker. Derfor kan DNA-templater av spesifikke gener, med eller uten tilførte reportersekvenser eller affinitetsmerkesekvenser, utformes som maler for ekspresjon av det overvåkede stoffet. Slike forbindelser avledet fra slike DNA-maler kalles rekombinante proteiner.
Tradisjonelle strategier for ekspresjon av et stoff innebærer å transfisere celler med en DNA-vektor som inneholder en mal og deretter dyrke cellene for å transkribere og oversette det ønskede proteinet. Vanligvis blir cellene deretter lysert for å ekstrahere den uttrykte forbindelsen for påfølgende rensing. Det rekombinante proteinet CFP10-ESAT6 bearbeides på denne måten og går gjennom et rensesystem fra ev.dannelsen av giftstoffer. Først etter det skal den syntetiseres til en vaksine.
Både prokaryote og eukaryote in vivo ekspresjonssystemer for molekylære stoffer er mye brukt. Valget av system avhenger av typen protein, kravet til funksjonell aktivitet og ønsket utbytte. Disse ekspresjonssystemene inkluderer pattedyr, insekter, gjærsopp, bakterier, alger og celler. Hvert system har sine egne fordeler og utfordringer, og å velge riktig system for en bestemt applikasjon er viktig for vellykket uttrykk for stoffet som vurderes.
Uttrykk fra pattedyr
Bruken av rekombinante proteiner tillater utvikling av vaksiner og medisiner på ulike nivåer. For dette kan denne metoden for å oppnå et stoff brukes. Pattedyrekspresjonssystemer kan brukes til å produsere proteiner fra dyreriket som har den mest native strukturen og aktiviteten på grunn av deres fysiologisk relevante miljø. Dette resulterer i høye nivåer av post-translasjonell prosessering og funksjonell aktivitet. Pattedyrekspresjonssystemer kan brukes til å produsere antistoffer, komplekse proteiner og forbindelser for bruk i cellebaserte funksjonelle analyser. Disse fordelene er imidlertid kombinert med strengere kulturbetingelser.
Pattedyrekspresjonssystemer kan brukes til å generere proteiner forbigående eller gjennom stabile cellelinjer der ekspresjonskonstruksjonen er integrert i vertsgenomet. Mens slike systemer kan brukes i flere eksperimenter, er tidenproduksjon kan generere store mengder stoff på en til to uker. Denne typen rekombinant proteinbioteknologi er etterspurt.
Disse forbigående, høytytende pattedyrekspresjonssystemene bruker suspensjonskulturer og kan gi gram per liter. I tillegg har disse proteinene mer naturlig folding og post-translasjonelle modifikasjoner som glykosylering sammenlignet med andre ekspresjonssystemer.
Insektuttrykk
Metoder for å produsere rekombinant protein er ikke begrenset til pattedyr. Det er også mer produktive måter når det gjelder produksjonskostnader, selv om utbyttet av stoffet per 1 liter behandlet væske er mye lavere.
Insektceller kan brukes til å uttrykke et protein på høyt nivå med modifikasjoner som ligner på pattedyrsystemer. Det er flere systemer som kan brukes til å generere rekombinant baculovirus, som deretter kan brukes til å trekke ut stoffet av interesse i insektceller.
Uttrykk av rekombinante proteiner kan enkelt skaleres opp og tilpasses suspensjonskulturer med høy tetthet for storskala blanding av molekyler. De ligner mer funksjonelt på den opprinnelige sammensetningen av pattedyrmateriale. Selv om utbyttet kan være opptil 500 mg/L, kan produksjonen av rekombinant baculovirus være tidkrevende og dyrkingsforholdene er vanskeligere enn prokaryote systemer. Men i mer sørlige og varmere land, en lignendemetoden anses som mer effektiv.
Bakterieuttrykk
Produksjon av rekombinante proteiner kan etableres ved hjelp av bakterier. Denne teknologien er mye forskjellig fra de som er beskrevet ovenfor. Bakterielle proteinekspresjonssystemer er populære fordi bakteriene er enkle å dyrke, vokser raskt og gir høye utbytter av den rekombinante formuleringen. Imidlertid er multidomene eukaryote stoffer uttrykt i bakterier ofte ikke-funksjonelle fordi cellene ikke er utstyrt for å utføre de nødvendige post-translasjonelle modifikasjoner eller molekylær folding.
I tillegg blir mange proteiner uløselige som inklusjonsmolekyler, som er svært vanskelige å utvinne uten harde denaturatorer og påfølgende tungvinte molekylære refolding-prosedyrer. Denne metoden anses for det meste fortsatt å være eksperimentell.
Cell free expression
Rekombinant protein som inneholder aminosyresekvensen til stafylokinase oppnås på en litt annen måte. Den er inkludert i mange typer injeksjoner, og krever flere systemer før bruk.
Cellefri proteinekspresjon er en in vitro-syntese av et stoff ved bruk av translasjonskompatible helcelleekstrakter. I prinsippet inneholder helcelleekstrakter alle makromolekylene og komponentene som kreves for transkripsjon, oversettelse og til og med post-translasjonell modifikasjon.
Disse komponentene inkluderer RNA-polymerase, regulatoriske proteinfaktorer, transkripsjonsformer, ribosomer og tRNA. Når du legger tilkofaktorer, nukleotider og en spesifikk genmal, kan disse ekstraktene syntetisere proteiner av interesse på noen få timer.
Selv om det ikke er bærekraftig for storskala produksjon, tilbyr cellefrie eller in vitro proteinekspresjonssystemer (IVT) en rekke fordeler fremfor konvensjonelle in vivo-systemer.
Cellefri ekspresjon tillater rask syntese av rekombinante formuleringer uten å involvere cellekultur. Cellefrie systemer gjør det mulig å merke proteiner med modifiserte aminosyrer, samt å uttrykke forbindelser som gjennomgår rask proteolytisk nedbrytning av intracellulære proteaser. I tillegg er det lettere å uttrykke mange forskjellige proteiner samtidig ved hjelp av en cellefri metode (for eksempel testing av proteinmutasjoner ved småskala uttrykk fra mange forskjellige rekombinante DNA-maler). I dette representative eksperimentet ble IVT-systemet brukt til å uttrykke det humane caspase-3-proteinet.
Konklusjoner og fremtidsutsikter
Rekombinant proteinproduksjon kan nå sees på som en moden disiplin. Dette er resultatet av en rekke inkrementelle forbedringer i rensing og analyse. For tiden stoppes sjelden legemiddeloppdagelsesprogrammer på grunn av manglende evne til å produsere målproteinet. Parallelle prosesser for ekspresjon, rensing og analyse av flere rekombinante stoffer er nå godt kjent i mange laboratorier rundt om i verden.
Proteinkomplekser og økende suksess i å lagesolubiliserte membranstrukturer vil kreve flere endringer for å holde tritt med etterspørselen. Fremveksten av effektive kontraktsforskningsorganisasjoner for en mer regelmessig tilførsel av proteiner vil tillate omfordeling av vitenskapelige ressurser for å møte disse nye utfordringene.
I tillegg bør parallelle arbeidsflyter tillate opprettelse av komplette biblioteker av det overvåkede stoffet for å muliggjøre ny målidentifikasjon og avansert screening, sammen med tradisjonelle småmolekylære legemiddeloppdagelsesprosjekter.
