Når man studerer stoffer i organisk kjemi, brukes mer enn et dusin forskjellige kvalitative reaksjoner for å bestemme innholdet av visse forbindelser. En slik visuell analyse lar deg umiddelbart forstå om de nødvendige stoffene er til stede, og hvis de ikke er til stede, kan du redusere ytterligere eksperimenter betydelig for å identifisere dem. Disse reaksjonene inkluderer ninhydrin, som er den viktigste i den visuelle bestemmelsen av aminoforbindelser.
Hva er dette?
Ninhydrin er en dikarbonylforbindelse som inneholder én aromatisk ring med en heterosykkel festet til den, hvor det andre atomet har 2 hydroksylgrupper (OH-). Dette stoffet oppnås ved direkte oksidasjon av inandion - 1, 3, og har derfor, i henhold til den internasjonale nomenklaturen, følgende navn: 2, 2 - dihydroksyinandion -1, 3 (fig. 1).
Rent ninhydrin er en gul eller hvit krystallfarger som ved oppvarming oppløses godt i vann og andre polare organiske løsemidler, som aceton. Dette er et ganske skadelig stoff, hvis det kommer i kontakt med huden i store mengder eller slimhinner, forårsaker det irritasjon, også ved innånding. Arbeid med denne blandingen bør være forsiktig og kun med hansker, som når den kommer i kontakt med huden, reagerer den med hudcelleproteiner og farger den lilla.
Reaktive stoffer
Som nevnt ovenfor, brukes ninhydrinreaksjonen primært til visuell bestemmelse av innholdet av aminoforbindelser:
- α-aminosyrer (inkludert i proteiner);
- aminosukker;
- alkaloider som inneholder –NH2 og -NH-grupper;
- ulike aminer.
Det bør bemerkes at sekundære og tertiære aminer noen ganger reagerer veldig svakt, så mer forskning er nødvendig for å bekrefte deres tilstedeværelse.
Ulike metoder for kromatografi brukes for kvantitativ bestemmelse, for eksempel papirkromatografi (BC), tynnsjiktskromatografi (TLC) eller med vasking av faste bærere med en løsning av ninhydrin i ulike medier.
Denne reaksjonen er ikke spesifikk for aminoforbindelser, siden reagenset kan gå inn i den med alt på en gang. På reaksjonsproduktenes side har det imidlertid en særegenhet i form av frigjøring av karbondioksidbobler (CO2), og dette er typisk bare når det interagerer med α-amino syrer.
Mekanismefunksjoner
BDet er forskjellige tolkninger av ninhydrinreaksjonsligningen i litteraturen. Noen forskere utelater dannelsen av hydrindanthin fra 2-aminoinandion, som, med deltakelse av ammoniakk og ninhydrin, også danner et fargestoff k alt "Rueman's purple" (eller "Rueman's blue"), mens andre tvert imot antar bare dets deltakelse uten tilstedeværelse av mellomliggende aminoprodukter. Det er også noen interessante punkter i registreringen av selve reaksjonen, spesielt gjelder dette metodene for å feste aminoderivatet av ninhydrin til hovedmolekylet for å danne et fargestoff. Indikasjonen av stedet for "vandrende hydrogen" oppnådd av intermediær amin fra det vandige mediet er fortsatt tvilsom: det kan enten være i ketongruppen eller ved siden av –NH2.
I virkeligheten er nyansen med H-atomet ubetydelig, siden dets plassering i forbindelsen ikke spiller noen spesiell rolle i reaksjonsforløpet, så det bør ikke tas hensyn til. Når det gjelder utelatelsen av et av de mulige stadiene, ligger årsaken her i det teoretiske aspektet: til nå har den nøyaktige mekanismen for dannelsen av Ruemans lilla ikke blitt nøyaktig bestemt, så ganske forskjellige skjemaer for ninhydrinreaksjonen kan bli funnet.
Det mest komplette mulige interaksjonsforløpet mellom reagenset og aminoforbindelser vil bli foreslått nedenfor.
Reaksjonsmekanisme
For det første interagerer ninhydrin med α-aminosyre, fester den på stedet for sp altning av hydroksygrupper og danner et kondensasjonsprodukt (fig. 2a). Deretter blir sistnevnte ødelagt, og frigjør mellomproduktet amin, aldehyd og karbondioksid (fig. 2b). Fra sluttproduktet ved sammenføyningninhydrin, syntetiseres Rueman-lilla strukturen (diketonhydrindenketohydrinamine, fig. 2c). Også indikert er mulig dannelse av hydrindanthin (redusert ninhydrin) fra det mellomliggende aminet, som også blir til en fargestoff i nærvær av ammoniakk (mer presist, ammoniumhydroksid) med et overskudd av selve reagenset (fig. 2d).
Dannelsen av hydrindantin ble bevist av Rueman selv når hydrogensulfid virker på ninhydrinmolekylet. Denne forbindelsen er i stand til å løse seg opp i natriumkarbonat Na2CO3, og farger løsningen mørkerød. Og når fortynnet s altsyre tilsettes, faller hydrindanthin ut.
Mest sannsynlig er det mellomliggende aminet, hydridanthin, ninhydrin og strukturen til fargestoffet, på grunn av deres ustabilitet ved oppvarming, i en viss likevekt, noe som muliggjør tilstedeværelsen av flere tilleggsstadier.
Denne mekanismen er egnet for å forklare ninhydrinreaksjonen med andre aminoforbindelser, med unntak av biprodukter som er et resultat av eliminering av resten av strukturen fra –NH2, -NH eller -N.
Biuret-test og andre reaksjoner på proteiner
Kvalitativ analyse for peptidbindinger selv av ikke-proteinstrukturer kan finne sted ikke bare med deltagelse av ovennevnte reagens. Men i tilfelle av en ninhydrinreaksjon til proteiner, skjer ikke interaksjonen langs –CO-NH-grupper, men langs amingrupper. Det er en såk alt "biuretreaksjon", som er preget av tilsetning av ioner til løsningen med aminoforbindelserbivalent kobber fra CuSO4 eller Cu(OH)2 i et alkalisk medium (fig. 3).
Under analysen, i nærvær av de nødvendige strukturene, blir løsningen mørkeblå på grunn av bindingen av peptidbindinger til et fargekompleks, som skiller en reagens fra en annen. Det er derfor biuret- og ninhydrinreaksjonene er universelle i forhold til protein- og ikke-proteinstrukturer med –CO-NH‒-gruppen.
Ved bestemmelse av sykliske aminosyrer brukes en xantoproteinreaksjon med en konsentrert løsning av salpetersyre HNO3 , som gir en gul farge ved nitrering. En dråpe reagens på huden viser også en gul farge ved å reagere med aminosyrene i hudcellene. Salpetersyre kan forårsake brannskader og bør også håndteres med hansker.
Eksempler på interaksjon med aminoforbindelser
Ninhydrinreaksjon for α-aminosyrer gir et godt visuelt resultat, bortsett fra fargene prolin og hydroksyprolinstrukturer, som reagerer med dannelse av en gul farge. En mulig forklaring på denne effekten ble funnet i andre miljøforhold for interaksjonen av ninhydrin med disse strukturene.
Reaksjon med aminogruppe
Siden testen ikke er spesifikk, er visuell påvisning av alanin ved hjelp av ninhydrinreaksjonen i blandingen ikke mulig. Men ved papirkromatografi, når man påfører prøver av forskjellige α-aminosyrer, sprayer dem med en vandig løsning av ninhydrin og utvikler i et spesielt medium, kan manberegne den kvantitative sammensetningen av ikke bare den påståtte forbindelsen, men også mange andre.
Skjematisk følger samspillet mellom alanin og ninhydrin det samme prinsippet. Den fester seg til reagenset ved amingruppen, og under påvirkning av aktive hydroniumioner (H3O+) sp altes det ved karbonet -nitrogenbinding, sp altes til acetaldehyd (CH3COH) og karbondioksid (CO2). Et annet ninhydrinmolekyl fester seg til nitrogen og fortrenger vannmolekyler, og det dannes en fargestruktur (fig. 4).
Reaksjon med en heterosyklisk aminoforbindelse
Ninhydrinreaksjonen med prolin er spesifikk, spesielt i kromatografiske analyser, siden slike strukturer i et surt medium først blir gule, og deretter blir lilla i et nøytr alt. Forskerne forklarer dette med et trekk ved syklusomorganiseringen i den mellomliggende forbindelsen, som påvirkes nettopp av tilstedeværelsen av et stort antall hydrogenprotoner som komplementerer det ytre energinivået til nitrogen.
Ødeleggelsen av heterosyklusen skjer ikke, og et annet ninhydrinmolekyl er festet til det ved det 4. karbonatomet. Ved ytterligere oppvarming blir den resulterende strukturen i et nøytr alt medium til Rueman lilla (fig. 5).
Forberedelse av hovedreagensen
Ninhydrintest utføres med forskjellige løsninger, avhengig av oppløsning av aminostrukturer i visse organiske oguorganiske forbindelser.
Hovedreagensen er fremstilling av en 0,2 % løsning i vann. Dette er en allsidig blanding, siden de fleste forbindelser løses godt opp i H2O. For å oppnå et nylaget reagens, fortynnes en prøve på 0,2 g kjemisk rent ninhydrin i 100 ml vann.
Det er verdt å merke seg at for noen analyserte løsninger er denne konsentrasjonen utilstrekkelig, så 1 % eller 2 % løsninger kan tilberedes. Dette er typisk for ekstrakter fra medisinske råvarer, siden de inneholder ulike klasser av aminoforbindelser.
Når man utfører kromatografiske studier, kan løsninger, for eksempel når man vasker en blanding på en fast bærer gjennom en kolonne, fremstilles i alkohol, dimetylsulfoksid, aceton og andre polare løsningsmidler - alt vil avhenge av løsningsmidlet til visse aminostrukturer.
Application
Ninhydrinreaksjonen gjør det mulig å påvise mange aminoforbindelser i løsning, noe som gjorde den til en av de første som ble brukt i kvalitativ analyse av organiske stoffer. Visuell bestemmelse reduserer antallet eksperimenter betydelig, spesielt når man analyserer dårlig studerte planter, legemidler og doseringsformer, samt ukjente løsninger og blandinger.
I rettsmedisinsk vitenskap er denne metoden mye brukt for å fastslå tilstedeværelsen av svettemerker på enhver overflate.
Selv til tross for den uspesifikke reaksjonen, er det umulig å trekke ninhydrinreaksjonen ut av kjemisk praksis, sidenå erstatte dette stoffet med mindre giftige analoger (for eksempel oksolin) viste at de har dårligere følsomhet for aminogrupper og ikke gir gode resultater i fotometriske analyser.
