Hva ligger til grunn for DNA-hybridisering? Selv om den dobbelttrådete DNA-sekvensen generelt er stabil under fysiologiske forhold, vil endring av disse forholdene i laboratoriet (typisk ved å heve omgivelsestemperaturen) føre til at molekylene skilles i individuelle tråder. De sistnevnte er komplementære til hverandre, men kan også komplementere andre sekvenser som er tilstede i deres miljø. Senking av omgivelsestemperaturen gjør at enkelttrådede molekyler kan anneale eller "hybridisere" med hverandre. Dette er DNA-hybridiseringsmetoden.
Konseptet fra molekylærbiologiens synspunkt
Forskere som er involvert i både DNA-replikasjon og transkripsjon av DNA til RNA, er avhengige av nukleotidkryssninger og molekylærbiologiske teknikker. Dette inkluderer Southern og Northern blots, polymerasekjedereaksjon (PCR) og de fleste DNA-RNA hybridisering og sekvenseringsmetoder.
Application
Hybridisering er hovedegenskapen til nukleotidsekvenser og brukes i en rekke metoder for molekylærbiologi. Det generelle genetiske forholdet til to arter kan bestemmes ved å hybridisere segmenter av deres DNA (DNA-DNA hybridisering). På grunn av sekvenslikheter mellom nært beslektede organismer, kreves det høyere temperatur for å smelte slike DNA-hybrider sammenlignet med fjernere organismer. Ulike metoder bruker hybridisering for å bestemme opprinnelsen til en DNA-prøve, inkludert polymerasekjedereaksjonen (PCR). I en annen metode hybridiseres korte DNA-sekvenser til cellulært mRNA for å identifisere uttrykte gener. Farmasøytiske selskaper undersøker bruken av antisense-RNA for å binde seg til uønsket mRNA, og hindrer ribosomet i å oversette mRNA til protein.
DNA-DNA-hybridisering refererer generelt til en molekylærbiologisk teknikk som måler graden av genetisk likhet mellom samlinger av DNA-sekvenser. Det brukes ofte til å bestemme den genetiske avstanden mellom to organismer. Det har vært mye brukt i fylogeni og taksonomi.
Metode
DNA fra én organisme ble merket, deretter blandet med umerket DNA som kunne sammenlignes med den. Blandingen inkuberes for å tillate DNA-trådene å dissosiere og deretter avkjøles for å danne et regenerert hybrid dobbelttrådet DNA. Hybridiserte sekvenser med høy grad av likhet vil binde seg tettere og kreve mer energi for å skille dem: det vil si at de skiller seg når de varmes opp til en høyeretemperatur enn ulik sekvens, en prosess kjent som "DNA-smelting".
DNA-smelting
Vurderer smelteprofilen til det hybridiserte DNA, det dobbelttrådete DNA bindes til en såk alt "kolonne" og den resulterende blandingen varmes opp. Ved hvert trinn vaskes kolonnen og DNA-sekvensene som smelter blir enkelttrådet og vaskes av kolonnen. Temperaturene ved hvilke merket DNA forlater kolonnen reflekterer mengden av likhet mellom sekvenser (og det selvfoldende mønsteret fungerer som en kontroll). Disse resultatene kombineres for å bestemme graden av genetisk likhet mellom organismer. I følge moderne mikrobiologi er DNA-hybridisering umulig uten å forstå disse tingene.
Når flere arter av ribonukleinsyre (eller deoksyribonukleinsyre) sammenlignes på denne måten, tillater likhetsverdiene at arten kan plasseres i det fylogenetiske treet. Derfor er dette en av de mulige tilnærmingene for å utføre molekylær systematikk. Charles Sibley og John Ahlquist, pionerene innen denne teknikken, brukte DNA-DNA-hybridisering for å studere fylogenetiske forhold mellom fugler (Sibley-Ahlquist-taksonomi) og primater.
Betydning for biologi
DNA-DNA-hybridisering er gullstandarden for å skille bakteriearter, med en likhetsverdi på mer enn 70 %, noe som indikerer at de sammenlignede stammene tilhører forskjellige arter. I 2014 ble det foreslått en terskel på 79 % likhet for å separere en bakteriell underart.
Kritikere hevder at teknikken er unøyaktig for å sammenligne nært beslektede arter, ettersom ethvert forsøk på å måle forskjeller mellom ortologe sekvenser mellom organismer blir overveldet av hybridiseringen av paraloge motstykker i en organismes genom. DNA-sekvensering og beregningssekvenssammenligninger er for tiden den mest brukte metoden for å bestemme genetisk avstand, selv om denne tilnærmingen fortsatt brukes i mikrobiologi for å hjelpe med å identifisere bakterier.
Den nåværende måten er å utføre DNA-DNA-hybridisering i silikon ved å bruke helt eller delvis sekvenserte genomer. GGDC utviklet av DSMZ er det mest nøyaktige kjente verktøyet for å beregne DDH-lignende verdier. Blant andre algoritmiske forbedringer løser den problemet med paralogiske sekvenser ved å nøye filtrere dem ut av samsvar mellom to genomsekvenser.
FISH-metode
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) er en laboratorieteknikk som brukes til å oppdage og sekvensere DNA, ofte på et spesifikt kromosom.
I 1969 publiserte Joseph Gall og Mary Lou Pardu en artikkel som demonstrerte at radioaktive kopier av en ribosomal DNA-sekvens kunne brukes til å oppdage komplementære DNA-sekvenser i kjernen til et froskegg. Siden disse originale observasjonene har mange forbedringer økt allsidigheten ogsensitiviteten til prosedyren i en slik grad at in situ hybridisering ("på plass", latin) nå anses som et viktig verktøy innen cytogenetikk. (Begrepet in situ brukes nå også for å referere til det innledende stadiet av karsinomvekst, når bare epitelvev er involvert i den patologiske prosessen.)
Fluorescerende hybridiseringssekvens
RNA-prober kan designes for et hvilket som helst gen eller hvilken som helst sekvens i et gen for å visualisere lncRNA og miRNA mRNA i vev og celler. FISH brukes til å studere syklusen for celle-reproduksjon, spesielt nukleær interfase for eventuelle kromosomavvik. FISH lar deg analysere en stor serie med arkivsaker, det er mye lettere å identifisere det identifiserte kromosomet ved å lage en sonde med en kunstig kromosombase som vil tiltrekke seg lignende kromosomer.
Hybridiseringssignaler for hver probe når en nukleær abnormitet oppdages: hver mRNA- og lncRNA-deteksjonsprobe består av 20 par oligonukleotider, hvert par dekker et rom på 40-50 bp. s. Prober bruker proprietær kjemi for å oppdage mRNA.
Hybridisering med DNA-prober
Prober er ofte laget av DNA-fragmenter som er blitt isolert, renset og amplifisert for bruk i utformingen av det menneskelige genomet. Størrelsen på det menneskelige genomet er så stort sammenlignet med lengden som kan sekvenseres direkte at det er nødvendig å dele det inn ifragmenter. Til syvende og sist ble disse fragmentene ordnet ved å fordøye en kopi av hvert fragment til enda mindre enheter ved å bruke sekvensspesifikke endonukleaser for å måle størrelsen på hvert lite fragment ved bruk av størrelseseksklusjonskromatografi ved å bruke denne informasjonen for å bestemme hvor store fragmenter overlappet med hverandre..
For å bevare elementene med deres individuelle DNA-sekvenser, ble fragmentene lagt til et system med stadig gjentakende bakteriepopulasjoner. Klonale populasjoner av bakterier, hver populasjon opprettholder et enkelt kunstig kromosom, lagres i forskjellige laboratorier rundt om i verden. Kunstige kromosomer (BACs) kan dyrkes, ekstraheres og merkes i ethvert laboratorium som inneholder et bibliotek. Genomiske biblioteker er ofte oppk alt etter institusjonene der de ble utviklet. Et eksempel er RPCI-11-biblioteket, oppk alt etter Roswell Cancer Institute i Buffalo (New York, USA). Disse fragmentene utgjør omtrent 100 tusen basepar og er grunnlaget for de fleste FISH-prober.
