Dyrking av bakterier: metoder, prinsipper, trinn og forhold

2024 Forfatter: Angel Austin | [email protected]. Sist endret: 2023-12-17 05:37

Mikroorganismer i naturen rundt oss er over alt: i jordsmonn, vannforekomster, på overflaten av ulike gjenstander, er mennesker og dyr bebodd av dem. Alt dette kan tjene som kilder til mikrobiell forurensning av mat, medisiner og produksjonslinjer. Dyrking av bakterier er nødvendig for å studere deres egenskaper, behov og egenskaper. Dette er igjen et viktig skritt i utviklingen av ulike legemidler, laboratoriediagnostikk av sykdommer, beregning av produksjonsreaktorer og mye mer.

Generelle konsepter

Bakteriedyrking i mikrobiologi refererer til dyrking av mikroorganismer utført i laboratoriet. På sin side kalles mikrober som har vokst på et utvalgt næringsmedium en kultur. Kulturer kan blandes hvis de er dannet av forskjellige typer mikroorganismer, og rene hvis de er representert av bare én type bakterier.

Hvis ernæringsmessigBare én celle er plassert i mediet, og en gruppe individer oppnås som et resultat av dens reproduksjon, da kalles dette settet med mikroorganismer en klon. Når en klon utvikler seg til et punkt hvor den blir synlig for det blotte øye, kalles denne samlingen av bakterier en koloni.

Vanligvis utføres dyrking av bakterier isolert fra forskjellige kilder separat fra hverandre. Hver slik separat dyrket gruppe av mikrober kalles en stamme. Så hvis en type stafylokokker er isolert fra tre kilder (eller forskjellige deler av det samme produktet, forskjellige personer), snakker de om tre stammer av denne typen stafylokokker.

Bakterievekstfaktorer

Disse inkluderer ulike aminosyrer, lipider, purinbaser og andre forbindelser som er nødvendige for utvikling av mikroorganismer. Noen mikrober kan selvstendig produsere stoffene de trenger, mens andre trenger å motta dem i ferdig form. I henhold til behovene til mikroorganismer i visse vekstfaktorer, utføres identifikasjon og differensiering av bakterier. Denne parameteren er også viktig for riktig tilberedning av et næringsmedium for laboratorie- og bioteknologisk arbeid:

• Aminosyrer. Bakterier kan kreve én bestemt aminosyre eller gruppe av syrer. Så, clostridia trenger leucin og tyrosin, streptokokker trenger leucin og arginin. Mikroorganismer som krever aminosyrer utenfra for å vokse kalles auxotrofer.
• Purin- og pyrimidinbaser, samt deres derivater (adenin, guanin og andre). De er en viktig faktor i veksten for mangeStreptokokkarter.
• Vitaminer. De er en del av koenzymene som kreves av bakterier. Så nikotinsyre, så vel som dets amid, som er en del av NAD og NADP, er nødvendig for difteri og shigella corynebacteria. Tiamin, som en integrert del av pyrofosfat, kreves av Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Pantotensyre, som er en del av CoA-koenzymet, kreves av tetanusbasiller og visse typer streptokokker. Cytokromer, og derfor folsyre, hemer og biotin som danner dem, er nødvendige for Mycobacterium tuberculosis og Haemophilus influenzae.

Miljøkrav

Betingelser for dyrkingsmedier for dyrking av bakterier:

1. Ernæring. De må dessuten inneholde stoffer i en lett fordøyelig form som er nødvendig for at mikroorganismer skal kunne mate og fylle på energi. Disse inkluderer organogener og mineraler. Noen mikroorganismer krever i tillegg vitaminer og aminosyrer som de ikke kan syntetisere.
2. Optim alt pH-nivå. Det påvirker permeabiliteten til cellemembranen og følgelig evnen til å absorbere næringsstoffer av bakterien. Som oftest bør pH-verdien ligge på nivået 7, 2–7, 4. Mange mikroorganismer produserer i løpet av livet produkter med sure eller alkaliske reaksjoner, og for at pH i næringsmediet ikke skal endre seg. den må bufres.
3. Isotonisk. Det osmotiske trykket i næringsmediet for dyrking av bakterier bør ha samme verdier sominne i mikrobielle celler. Det tilsvarer vanligvis en 0,5 % NaCl-løsning.
4. Sterilitet. Dette skyldes det faktum at utseendet til fremmede bakterier vil forvrenge resultatene av studien av den analyserte stammen.
5. fuktighetsnivå. Denne indikatoren, sammen med konsistensen til mediet, bør ha optimale egenskaper for en bestemt type bakterier.
6. Redox-potensial (RH2). Den viser forholdet mellom stoffer som donerer og aksepterer elektroner, samt nivået av oksygenmetning i næringsmediet. For aerober og anaerobe er betingelsene for dyrking av bakterier noe forskjellige i denne indikatoren. Anaerobe mikroorganismer reproduserer best ved RH2-verdier under 5 og aerobe mikroorganismer ved minst 10.
7. Uniformitet. Det er viktig at kulturmediet inneholder konstante mengder av dets individuelle ingredienser. I tillegg foretrekkes klare løsninger, som gjør det lettere å overvåke avlingsvekst eller oppdage forurensning.

Typer kulturmedier

Valget av et bestemt medium for dyrking av mikroorganismer påvirkes av mange faktorer, blant annet egenskapene til deres ernæring og formålet med studien. Hovedtrekkene som ligger til grunn for klassifiseringen av næringsmedier er:

1. Komponenter. I henhold til de opprinnelige stoffene som ble brukt til å lage substratet, skiller de:

• naturlig, som er tilberedt av produkter av animalsk eller vegetabilsk opprinnelse (f.eks. kjøtt, melk, frukt) og er egnet for blandingsdyrkingavlinger;
• halvsyntetisk, der dyre naturlige matprodukter erstattes av ikke-matprodukter (for eksempel beinmel, blodpropp), og som er optimale for å dyrke visse typer bakterier eller isolere deres metabolske produkter fra miljø;
• syntetisk, som er fremstilt av nøyaktige mengder kjemiske forbindelser, har en kjent konstant sammensetning og er lett reproduserbare.

2. Konsistens (tetthet). Skille miljøer:

• liquid;
• dense;
• semi-liquid.

De to siste er tilberedt av spesielle løsninger eller flytende stoffer med tilsetning av agar-agar eller gelatin for å skape den nødvendige tettheten. I tillegg er et tett miljø for vekst av bakterier koagulert blodserum, poteter, silikagelmedier, karragenan.

3. Sammensatt. På dette grunnlaget er miljøene:

• enkelt, listen over som er kort er Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), næringsgelatin og peptonvann.
• kompleks, tilberedt av enkle med tilsetning av blod, myse, karbohydrater og andre stoffer.

4. Avtale. Følgende næringsmedier skilles ut:

• main brukes til å dyrke mange patogene mikrober (vanligvis enkel sammensetning);
• spesielle brukes til å isolere og dyrke bakterier som ikke vokser på enkle underlag;
• selektive (de er også selektive) er egnet for å isolere en spesifikk type bakterier og hemmer veksten av assosierte mikrober (selektivitetopprettet ved å tilsette visse stoffer til mediet, for eksempel antibiotika eller s alter, eller ved å justere pH);
• Differensialdiagnostikk gjør det mulig å skille en type bakterier fra en annen ved å vurdere den enzymatiske aktiviteten til for eksempel mediet;
• konserveringsmidler er nødvendig for første inokulering med påfølgende transport av prøver, da de forhindrer død av mikroorganismer, samt hemmer veksten av andre bakterier.

Medieforberedelse

Det viktigste trinnet i dyrkingen av anaerobe bakterier er tilberedningen av et egnet næringsmedium. Etter at de optimale parameterne er valgt, fortsett til følgende trinn:

• veiing, ved å velge en prøve av komponenter på en analytisk vekt;
• oppløsning utføres i destillert vann oppvarmet til 70 °C, og fosfater, mikro- og makros alter løses separat;
• koking i vannbad i to minutter;
• pH-bestemmelse med indikatorpapir eller potensiometer;
• filtrering gjennom våt klut eller papirfiltre for flytende så vel som smeltede tette medier, og gjennom et bomullsgasfilter for agarmedier;
• tapping utført med 3/4 kapasitet;
• middels avhengig sterilisering;
• kontroll for sterilitet utføres ved å sette seg i to dager i en termostat, etterfulgt av visning;
• kjemisk kontroll for å etablere pH og innhold av nødvendigvarer;
• biologisk kontroll ved prøveinokulering.

Sterilisering av glass og media

Et av grunnprinsippene for bakteriedyrking er sterilitet. Vekst og utvikling av fremmede mikroorganismer kan påvirke egenskapene til næringsmediet ved å endre dets kjemiske sammensetning og pH. Sterilisering er hovedbetingelsen for å dyrke rene kulturer. I praksis betyr dette begrepet metodene for ødeleggelse av absolutt alle livsformer på overflaten og i volumet av steriliserte gjenstander. Fartøy, instrumenter som brukes, media og andre gjenstander som ble brukt under studien, steriliseres.

Noen typer sterilisering:

• Tenning. Sterilisering av løkker og nåler for såing, glassplater, noen instrumenter kan utføres ved hjelp av en brenner eller spritlampe.
• Kokende. Egnet for håndtering av sprøyter, nåler, mat, men dreper ikke bakteriesporer.
• Tørrvarmesterilisering. Den utføres i et spesielt tørkeskap og er egnet for behandling av kolber, reagensrør og annet laboratorieglass.
• Dampsterilisering. Utført i en autoklav er denne metoden svært effektiv. Men det er ikke egnet for næringsmedier som inneholder proteiner eller andre forbindelser som brytes ned ved høye temperaturer. Mer sparsomt kan kalles tyndalisering. Den utføres i Koch Boiler og kombinerer spiring av sporer med deres ødeleggelse.
• Pasteurisering. Det brukes til medier som endrer egenskapene deres når de kokes (for eksempel melk, vin, øl), i stand tilkvitt dem fra ikke-sporebærende mikroorganismer. Behandlingstemperaturen er bare 50-60 ° C i femten til tretti minutter. I noen tilfeller brukes kaldsterilisering, utført med filtre eller UV-stråler.

Bakteriedyrkingsforhold

Vekst og utvikling av bakterier er bare mulig under visse faktorer og verdiene til hver av dem:

1. Temperatur. Det er tre grupper av bakterier som er forskjellige i temperaturpreferanser:

• termofiler, eller varmekjære mikrober, vokser ved 45-90°C, noe som betyr at de ikke formerer seg i menneske- og dyreorganismer;
• psykrofiler, eller kuldeelskende mikroorganismer, foretrekker temperaturer i området 5-15 °C og dyrkes i kjølelagre;
• mesofiler, utvikler seg ved en temperatur på 25-37 °C, de inkluderer mesteparten av bakterier.

2. Lys. Det er et trekk ved dyrking av fototrofiske bakterier, siden de utfører fotosynteseprosessen. Men for de fleste mikrober er ikke belysning en forutsetning. Og til og med omvendt, ultrafiolett solenergi kan undertrykke utviklingen deres.

3. Vann. Alle mikroorganismer trenger vann i en tilgjengelig (flytende) form. Det er derfor frossen mat har liten eller ingen bakterievekst.

4. Surhet i miljøet. Dette prinsippet for dyrking av bakterier er allerede diskutert i detalj ovenfor.

5. Lufting. Oksygen, som et kjemisk element, er en integrert del av vann og et betydelig antall forbindelser som brukes tildyrking av mikroorganismer. Gassformig oksygen kan også være inneholdt i vann og andre væsker i oppløst form. En betydelig del av bakterier trenger en konstant tilførsel av oksygenmolekyler. Men for en rekke mikroorganismer er det unødvendig, eller enda verre, gassformig oksygen er giftig for dem, siden de ikke har katalase og peroksidase, som ødelegger giftige luftveisprodukter. Derfor er det viktigste trinnet i dyrkingen av anaerobe bakterier fjerning av O₂ molekyler fra næringsmediet.

6. Dyrking av mikroorganismer. Dyrking av aerobe og anaerobe bakterier utføres i forskjellige lag av miljøet og på forskjellige måter.

Dyrking av aerobe mikroorganismer

Dyrking av aerobe bakterier krever molekylært oksygen. For å oppnå rene aerobekulturer som med hell kan brukes i medisin og næringsmiddelindustri, brukes følgende metoder:

• overflate som vokser på tette medier eller i flytende medier (deres tynne lag) når oksygen kommer direkte fra luften;
• dypdyrking i flytende medier, når en økning i mengden oksygen oppløst i dem oppnås ved konstant lufting.

Dyrking av anaerobe mikroorganismer

Det grunnleggende prinsippet for å dyrke bakterier av denne typen er deres minimale kontakt med atmosfærisk oksygen. Å gi betingelser for veksten deres er mye vanskeligere enn for aerobe. Følgende metoder brukes til å isolere anaerober fra molekylær O₂:

1. Fysisk. Denne metoden for dyrking av anaerobe bakterier reduseres til dyrking i et spesielt vakuumapparat - en mikroanaerostat. Luften i den er erstattet av en spesiell gassblanding av nitrogen med tilsetning av 10 % hydrogen og 5 % karbondioksid.
2. Kjemikalier. Disse inkluderer: bruk av absorberende midler (f.eks. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) eller reduksjonsmidler (som askorbinsyre).
3. Biologisk. Det kommer ned til samdyrking av aerober og anaerober i et lukket system. Denne metoden for å dyrke bakterier innebærer å så den ene halvdelen av en petriskål med noen av de aerobe bakterieartene, og den andre halvparten med den studerte anaerobe. Utviklingen vil begynne i det øyeblikket alt oksygenet er brukt opp.

Følgende såmetoder er egnet for dyrking av anaerobe bakterier:

• i overflatelaget;
• i overflatelaget fylt med steril parafin;
• i tykt av et tett næringsmedium;
• i dype lag med viskøse medier.

Å få ren kultur

Mikrobiologer arbeider vanligvis med prøver som er bebodd av mange forskjellige typer mikrober. Imidlertid, for å bestemme den systematiske posisjonen til mikroorganismer (familie, slekt, arter), samt for å studere deres egenskaper, er det nødvendig å isolere dem og dyrke en ren kultur. De har stor betydning i mange næringsmiddelindustrier, for eksempel ost, brød, kvass, vin osv. Dyrking av melkesyrebakterier gjør det mulig å få tak ien essensiell komponent for produksjon av fermenterte melkeprodukter, deig, kakao, ensilasje og til og med plast.

Fremgangsmåten for å isolere en ren kultur i et tett medium er basert på mekanisk separasjon av mikroorganismeceller med påfølgende isolert dyrking. Prøven overføres til et sterilt volum vann eller s altvann (volum 10-100 ml) og ristes deretter i to minutter. For å trekke ut mikroorganismer lokalisert i tykkelsen av materialet som studeres (for eksempel pølser eller ost), blir prøvestykkene først gnidd med sterile instrumenter med sand. Materialet som har gjennomgått forbearbeiding, som veier 1 g eller et volum på 1 ml, fortynnes med sterilt vann 10, 100, 1000, osv. ganger. Det velges fortynningsgrad som gir en konsentrasjon av celler som tilsvarer metodens muligheter.

Den etterfølgende dyrking av mikroorganismer er å tilberede et næringsmedium. Vanligvis velges et tett medium (MPA). Den smeltes først og avkjøles til 45-50 °C, og først deretter helles den i flere petriskåler (tre til fem stykker), på bunnen av hvilke vattpinner fra teststoffet med forskjellige konsentrasjoner plasseres. Deretter utføres blanding av det fortsatt ikke frosne næringsmediet og materialet innført i det. Dette er hvordan celler fikseres på forskjellige punkter i volumet av substratet.

Deretter plasseres petriskåler i en termostat i 2 dager ved 22 °C. I løpet av denne tiden formerer cellene seg i en slik grad at kolonien som dannes av hver av cellene blir synlig for det blotte øye. Hver av dem er en ren kultur av typen bakterier fra hvis celler detrose.

Etter det, fra petriskåler, blir mikroorganismer subkulturert til separate reagensglass fylt med et næringsmedium. På denne måten blir rene kulturer isolert fra en blandet prøve. Denne metoden bærer navnet på utvikleren - R. Koch. Det er også ofte k alt koppmetoden, eller utarmende såing. Etter å ha oppnådd rene kulturer av ulike typer bakterier, bestemmes deres form, sporer og familier.

Alt arbeid skal utføres etter prinsippene for asepsis. For å unngå for tidlig utvikling av mikroorganismer bør undersøkelsen utføres umiddelbart etter prøvetaking. Vann fra springen analyseres etter at de første porsjonene er tømt, siden de kan inneholde mikrober samlet i rør og kraner. Mikrofloraen av frukt, bær og grønnsaker er hovedsakelig lokalisert på overflaten (skall), derfor utføres vask fra den. For å gjøre dette, plasser fosteret i en steril beholder og fyll den med den nødvendige mengden vann. Deretter ristes de ganske kraftig og vannet helles over i en annen beholder. Avlinger fra tøyprodukter oppnås også i vattpinner, men på forhånd kuttes biter av en gitt størrelse ut av dem.