Gramfarging er mye brukt i mikrobiologi da det er en av de enkleste måtene å differensiere bakterier på basert på sammensetningen av celleveggen deres. I følge Gram kan alle bakterier deles inn i gram-positive (Gram (+)) og gram-negative (Gram (-)). Gram-fargemetoden ble utviklet i 1884 og har ikke mistet popularitet siden den gang, selv om den har blitt modifisert flere ganger.
Celleveggstruktur
Gramfarging avslører om en bakterie er Gram-positiv eller Gram-negativ. Delingen av bakterier i Gram (+) og Gram (-) utføres i samsvar med strukturen til celleveggen deres.
Celleveggen inneholder den største mengden peptidoglykan (murein) - et komplekst stoff, som inkluderer peptapeptid og glykan. Glykanen består av alternerende rester av N-acetylglukosamin og N-acetylmuraminsyre knyttet til hverandre med β-1,4-glykosidbindinger. Peptidoglykan gir vedlikehold av celleform, osmotisk beskyttelse og antigene funksjoner.
Hovedforskjeller mellom Gram-positive og Gram-negative bakterier
Ulike bakterier har forskjellige peptidoglykanlagtykkelser. Hos bakterier som er klassifisert som gram-positive, varierer det fra 15 til 80 nm, mens det hos gram-negative er fra 2 til 8 nm. Samtidig har Gram-negative bakterier en spesiell struktur under peptidoglykanlaget, som Gram-positive bakterier ikke har - det periplasmatiske rommet. Dette rommet er fylt med hydrolytiske enzymer - β-laktamase, ribonuklease 1, fosfatase. Det er disse enzymene som er ansvarlige for motstanden til gramnegative bakterier mot mange antibiotika.
Gram(-) peptidoglykanlaget av bakterier er bundet til lipopolysakkarid, en antigenstruktur som inneholder endotoksin. I Gram(+)-bakterier utfører teichoinsyrer lignende funksjoner.
Gram-negative bakterier har en tilleggsstruktur - den ytre membranen.
essensen av fargemetoden
Før du begynner å farge, tilberedes utstryk av de undersøkte bakteriene. For å gjøre dette dryppes vann på et glassglass og en kultur av mikroorganismer tilsettes der med en bakteriesløyfe. Deretter, etter at vannet har tørket helt, fikseres smøret - glassplaten bæres flere ganger over brennerflammen. Gramfarging er mer effektivt enn farging av levende bakterier – fargestoffmolekyler binder seg bedre til døde celler.
Farging gjøres i flere trinn:
- Små biter av filterpapir legges på et fast smøremiddel og hovedfargestoffet helles - gentianfiolett eller metylenblått.
- Etter 3-5 minutter, fjern det fargede filterpapiret og fyll smøret med Lugols løsning i 1 minutt. I dette tilfellet blir preparatet mørkere.
- Lugol-løsningen dreneres og smøret behandles med ren etylalkohol: noen få dråper dryppes på preparatet, dreneres etter 20 sekunder. Prosedyren gjentas 2-3 ganger.
- Skyll objektglasset med testpreparat med destillert vann.
- Produser ytterligere farging - avslutt preparatet med fuchsin. Etter 1-2 minutter vaskes fargen av.
- Etter at vannet har tørket, undersøk utstryket under et mikroskop. Gram-positive bakterier vil være blåfiolette, Gram-negative bakterier vil være rosa eller røde.
Årsaker til forskjellige fargemønstre
Som beskrevet ovenfor, Gram-farging av bakterier farger Gram-positive bakterier blåfiolette og Gram-negative bakterier røde eller rosa. Årsaken til differensiell farging av bakterier ved denne metoden er at etter at den løselige formen av gentianfiolett kommer inn i cellen, går fargestoffet over i den uløselige jodformen. Under behandlingen av bakterier med etylalkohol, ekstraheres lipider fra membranen under påvirkning av dette ikke-polare løsningsmidlet. Membranen blir da porøs og er ikke lenger en vesentlig barriere mot fargestoffutvasking. derimotpeptidoglykan er mer motstandsdyktig mot ikke-polare løsningsmidler, inkludert alkohol. Det er han som hindrer utvaskingen av fargestoffet, så bakterier med et tykt murein-lag blir blåfiolette (gram-positive), og etter behandling med alkohol endrer de ikke farge.
Tynt murein lag av gramnegative bakterier kan ikke holde fargestoffmolekylene i cellen, så etter påvirkning av alkohol blir de fargeløse - de farges gram-negativt.
Etter eksponering av et utstryk for fuksin forblir gramfargede bakterier blåfiolette, mens gramnegative bakterier blir rosa-røde.
Eksempler på Gram(+)- og Gram(-)-bakterier
Gram-negative bakterier inkluderer cyanobakterier, svovelbakterier, jernbakterier, klamydia, rickettsiae, eddikbakterier, mange metylobakterier, tioniske bakterier, arsenitobakterier, karboksybakterier.
Bifidobakterier, mange vannlevende bakterier, streptokokker og stafylokokker er grampositive.
