Molekylærbiologiske forskningsmetoder spiller en stor rolle i moderne medisin, rettsmedisin og biologi. Takket være fremskritt i studiet av DNA og RNA, er en person i stand til å studere genomet til en organisme, bestemme årsaken til en sykdom, gjenkjenne ønsket nukleinsyre i en blanding av syrer, osv.
Molekylærbiologiske forskningsmetoder. Hva er det?
Tilbake på 70- og 80-tallet lyktes forskere for første gang med å tyde det menneskelige genomet. Denne begivenheten ga drivkraft til utviklingen av genteknologi og molekylærbiologi. Studiet av egenskapene til DNA og RNA har ført til at det nå er mulig å bruke disse nukleinsyrene for å diagnostisere en sykdom, studere gener.
Få DNA og RNA
Molekylærbiologiske diagnostiske metoder krever tilstedeværelse av utgangsmateriale: oftere er det nukleinsyrer. Det er flere måter å isolere disse stoffene fra cellene til levende organismer. Hver av dem har sine egne fordeler og ulemper, og det er nødvendigta hensyn til når du velger en metode for å isolere rene nukleinsyrer.
1. Innhenting av DNA ifølge Marmur. Metoden består i å behandle en blanding av stoffer med alkohol, som et resultat av at rent DNA utfelles. Ulempen med denne metoden er bruken av aggressive stoffer: fenol og kloroform.
2. Isolering av DNA i henhold til Boom. Hovedstoffet som brukes her er guanidintiocyanat (GuSCN). Det bidrar til utfelling av deoksyribonukleinsyre på spesialiserte substrater, hvorfra den deretter kan samles opp ved hjelp av en spesiell buffer. GuSCN er imidlertid en hemmer av PTC, og selv en liten del av det som kommer inn i det utfelte DNA-et kan påvirke forløpet av polymerasekjedereaksjonen, som spiller en viktig rolle i arbeidet med nukleinsyrer.
3. Sedimentering av urenheter. Metoden skiller seg fra de tidligere ved at det ikke er molekylene av deoksyribonukleinsyre som utfelles, men urenheter. For å gjøre dette brukes ionebyttere. Ulempen er at ikke alle stoffer kan utfelles.
4. Massevisning. Denne metoden brukes i tilfeller hvor nøyaktig informasjon om sammensetningen av DNA-molekylet ikke er nødvendig, men det er nødvendig å innhente noen statistiske data. Dette forklares med det faktum at strukturen til nukleinsyren kan bli skadet når den behandles med vaskemidler, spesielt alkalier.
Klassifisering av forskningsmetoder
Alle molekylærbiologiske forskningsmetoder er delt inn i tre store grupper:
1. Amplifikasjon (ved bruk av mange enzymer). Herrefererer til PCR - polymerase chain reaction, som spiller en stor rolle i mange av de diagnostiske metodene.
2. Ikke-forsterkende. Denne gruppen av metoder er direkte relatert til driften av blandinger av nukleinsyrer. Eksempler er 3 blots, in situ hybridisering, osv.
3. Metoder basert på gjenkjennelse av et signal fra et probemolekyl som binder seg til et spesifikt probe-DNA eller RNA. Et eksempel er Hybride Capture System (hc2).
Enzymer som kan brukes i molekylærbiologiske forskningsmetoder
Mange molekylære diagnostiske metoder innebærer bruk av et bredt spekter av enzymer. Nedenfor er de mest brukte:
1. Restriksjonsenzym - "kutter" DNA-molekylet i de nødvendige delene.
2. DNA-polymerase - syntetiserer et dobbelttrådet molekyl av deoksyribonukleinsyre.
3. Revers transkriptase (revertase) - brukes til å syntetisere DNA på en RNA-mal.
4. DNA-ligase - ansvarlig for dannelsen av fosfodiesterbindinger mellom nukleotider.
5. Eksonuklease - fjerner nukleotider fra terminaldelene av deoksyribonukleinsyremolekylet.
PCR er hovedmetoden for DNA-amplifisering
Polymerase kjedereaksjon (PCR) brukes aktivt i moderne molekylærbiologi. Dette er en metode der et stort antall kopier kan oppnås fra et enkelt DNA-molekyl (molekyler forsterkes).
Hovedfunksjoner til PCR:
- diagnostikksykdommer;
- kloning av DNA-segmenter, gener.
Følgende elementer kreves for å utføre en polymerasekjedereaksjon: det initiale DNA-molekylet, en termostabil DNA-polymerase (Taq eller Pfu), deoksyribonukleotidfosfater (kilder til nitrogenholdige baser), primere (2 primere per 1 DNA-molekyl) og selve buffersystemet, der alle reaksjoner er mulige.
PCR består av tre trinn: denaturering, primer-annealing og forlengelse.
1. Denaturering. Ved en temperatur på 94-95 grader celsius brytes hydrogenbindingene mellom de to DNA-trådene, og som et resultat får vi to enkelttrådede molekyler.
2. Primer gløding. Ved en temperatur på 50-60 grader Celsius festes primere til endene av enkelttrådede nukleinsyremolekyler etter typen komplementaritet.
3. Forlengelse. Ved en temperatur på 72 grader skjer syntesen av datterdobbeltrådede molekyler av deoksyribonukleinsyre.
DNA-sekvensering
Molekylærbiologiske forskningsmetoder krever ofte kunnskap om nukleotidsekvensen i et deoksyribonukleinsyremolekyl. Sekvensering utføres for å bestemme den genetiske koden. Fremtidens molekylære diagnostikk vil være basert på kunnskap fra menneskelig sekvensering.
Følgende typer sekvensering er forskjellig:
- Maxam-Gilbert-sekvensering;
- Sanger-sekvensering;
- pyrosequencing;
- nanoporesekvensering.
